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揭秘各种主流二代测序仪,史上最全无瓜攻略

来源: 上海翊圣生物科技有限公司   2019-8-1   访问量:1105评论(0)

揭秘各种主流二代测序仪,史上最全无瓜攻略

随着基因领域研究的不断深入,自sanger测序实现对碱基信息的可读取后,更高通量的需求使得二代测序在基因组测序、临床检测和生物制药等领域展现出无与伦比的潜力。

对于刚入行的小伙伴,面对各式各样的测试平台好奇又迷茫,Roche454IlluminaThermo Fisher,以及国产MGI平台等,这么多测序仪,他们的特点是什么?背后的发展历程是怎样的?

今天小翊借花献佛,梳理了目前主流的二代测序平台,让我们了解二代测序这十几年的发展历程。

1二代测序部分仪器展示

罗氏454

Illumina

Thermo Fisher体系

华大智造

GS FLX

MiniSeq

Ion Proton

BIGseq50

备注:图片来源于各仪器品牌官网和网络

一、罗氏454 GS测序系统——昔日的辉煌

二代测序于2005年初登舞台,454公司基于焦磷酸测序法推出了Genome Sequencer 20 System(GS 20)系统,开启了边合成边测序(sequencing-by-synthesis)高通量测序的进程。2007年,罗氏公司收购了454,并推出了一系列性能更优的NGS系统,极大的提升测序通量和准确性,也进一步增加了测序读长。虽然罗氏454具有读长优势,但是测序通量和成本始终限制了454平台的推广,因此罗氏在2016年底终止了454 NGS测序相关的业务。

2罗氏454 GS测序仪器参数对比

GS FLX

GS FLX+

GS Junior

GS Junior+

读长

~600bp

~1,000bp

~500bp

~1,000bp

平均读长

450bp

700bp

400-500bp

700bp

测序通量

450M-650M

>700M**

35Mb

70Mb

测序长度分布

85%以上的reads>300bp20%以上的reads>500bp

85%以上的reads>500bp ; 45%以上的reads>700bp

99%以上的reads>400bp ;

-

最大reads

100M

100M

10M

10M

准确度

99。995%

99.997%

-

-

运行时间

10h

23h

10h

18h

样本要求

DNAcDNAPCR产物

DNAcDNA

基因组DNA、扩增子、cDNABAC

基因组DNA、扩增子、cDNABAC

应用领域

微生物群落多样性分析、复杂环境样品的宏基因组学研究、微生物基因组的de novo测序、转录组测序研究,此外还可应用于外显子测序、目标区域捕获、病原菌检测等研究。

备注:数据来源于罗氏官网和网络

二、Illumina测序仪——测序界的巨鳄

2006年,Solexa公司推出了Genome Analyzer系统(简称GA),其包括DNA簇(DNA cluster)、桥式PCRBridge PCR)和可逆阻断(Reversible terminator)等核心技术,这使得GA系统在高通量、低成本、应用范围广等方面具有明显优点。2007年,Illumina公司收购了Solexa,并在随后几年间发布了多种测序仪,主要包括两类:低通量的桌面式测序仪和高通量台式测序仪,基本覆盖行业内的各种测序应用,目前占据的测序市场份额超8成。

1Illumina HiSeq系列

HiSeq系列由Illumina公司2010年推出,该系列非常适合全基因组、转录组测序。20141月,Illumina宣布推出HiSeq X Ten测序平台,适用于大规模人群分析,包括10个可平行测序的超高通量测序仪,此系统号称为首个将人类全基因组测序成本降至1000美元或更低的测序平台。

测序原理:利用可逆性末端边合成边测序技术、四通道成像技术,每轮测序反应中存在4种核苷酸。

仪器特点:该系列仪器成本低,灵活性高,通量大。缺点是读长短和对每个测序反应产生的大量数据的存储和分析系统不足。

应用领域Hiseq2500适合大规模基因组学,Hiseq3000/4000适合生产级模板的基因组学,Hiseq X Five适合生产级规模的人类全基因组测序,Hiseq X Ten适合群体规模的测序。总体来说,Hiseq系列适合全基因组测序、靶向重测序、全转录组测序、de novo测序、表观遗传调控等。

2Illumina MiSeq

MiSeq系列由Illumina公司2011年推出,与Hiseq分享主要的核心技术,但是体积和通量更小、价格低,Miseq更佳便于扩增子和细菌样本测序,更佳适合临床使用。

测序原理:可逆性末端边合成边测序技术、四通道成像技术。

仪器特点:易于操作,体积小巧,可进行双向扩增子测序,样本制备简易,具有2x300 bp的读长,实现高达15 Gb的产出。缺点是不适合WGSWES测序。

应用领域MiSeq系列快速简约,适合小型基因组测序(微生物、病毒)、靶向基因测序(扩增子、基因集合)16S宏基因组测序、靶向基因表达谱、长片段扩增子测序、DNA-蛋白互作分析及miRNA和小RNA分析等。

3Illumina Nextseq 500

Nextseq 500Illumina公司于2014年推出的一款高通量台式测序仪,其大小与Miseq

相当,性能却与Hiseq相当。

测序原理:改良型边合成边测序(两通道SBS)化学原理。

仪器特点:运行时间短、测序质量高,全基因组、外显子和RNA测序可在一个平台完成,改良型技术效率更高。

应用领域:适合大型全基因组测序(人类、植物、动物)、小型基因组测序(微生物、病毒)外显子组测序、靶向基因测序(扩增子、基因集合)全转录组测序、基因表达谱(mRNA-Seq)、miRNA和小RNA分析、DNA-蛋白互作分析、甲基化测序和16S宏基因组测序。

4Illumina MiniSeq

测序原理:可逆性末端边合成边测序技术、双通道成像技术。

仪器特点:运行时间短、选择灵活,测序质量更高。缺点是不适合WGSWES测序。

应用领域:适合大型全基因组测序(人类、植物、动物)、小型基因组测序(微生物、病毒)外显子组测序、靶向基因测序(扩增子、基因集合)全转录组测序、基因表达谱(mRNA-Seq)、miRNA和小RNA分析、DNA-蛋白互作分析、甲基化测序和16S宏基因组测序。

MiniSeq Illumina公司于20161月发布的一款小型桌面式测序仪,体积比Miseq仪器小44%

5Illumina NovaSeq系列

NovaSeq系列是Illumina公司于20171月发布的可扩展的高通量测序仪,该系列有50006000两种系统,并且具有可选择的不同数量流动槽芯片的测序模式。

测序原理:可逆性末端边合成边测序技术、整合了图案化流动槽技术。

仪器特点:可扩展、通量高、选择灵活、簇密度和产出更高。

应用领域:使用范围广,以上4种类型仪器的测序领域均可覆盖。

Illumian公司系列测序仪参数对比如表3所示:

3 Illumina测序仪器参数对比

iSeq 100

MiniSeq

MiSeq Series

NextSeq Series

HiSeq 4000

HiSeq X Series

NovaSeq 6000

平台类型

桌面式

桌面式

桌面式

桌面式/大规模

大规模测序

大规模测序

大规模测序

读长

2×150bp

2×150bp

2×300bp

2×150bp

2×150bp

2×150bp

2×150/250bp

测序通量

1.2Gb

7.5Gb

15Gb

120Gb

1500Gb

1800Gb

6000Gb

最大reads

4million

25million

25million

400million

5billion

6billion

20billion

运行时间

9-17.5h

4–24h

4–55h

12–30h

<1–3.5d

<3d

<44h

备注:数据来源于Illumina官网

三、Thermo Fisher体系测序仪——测序的联合王国

2008ABIInvitrogen合并成为Life technologies公司,20108月,Life TechnologiesIon Torrent收购,2013年,Life TechnologiesThermo Fisher收购,借此Thermo Fisher正式入驻测序行业,旗下测序体系包括ABI SOLIDIon-Proton两种平台。

1ABI SOLID

ABI在收购了Agencourt Personal Genomics测序公司后,推出了SOLiD™ 5500SOLiD™ 5500xl新一代测序仪,为广大科研工作者提供更为全面的NGS服务解决方案。

测序原理微乳滴PCR与微球相结合的策略来扩增DNA模板,并在测序过程中对碱基间隔反复的读取,拼接合成后最终获得整条模板片段的完整序列信息。

仪器特点:测序通量已达到45Gb/天,准确率高达99.99%。并且SOLiD系统对于高GC含量的样本,也具有非常大的优势。缺点是读长较短,测序时间长。

应用领域:全基因组测序、染色质免疫共沉淀(ChIP)、微生物测序、数字核型分析、临床测序、基因型分析、基因表达分析和小分子RNA的发现等等。

2Ion PGM

Life Technologies公司于2010推出了首款半导体个人化操作基因组测序仪Ion PGM™,主要用于小基因组和外显子的测序。

测序原理:基于离子半导体测序技术,检测碱基掺入过程中释放氢离子,不用荧光、化学发光和酶级联反应,通过高敏的离子传感器获得信号数据。

仪器特点:样本消耗少,准确性达到99.97%,提供3种芯片测序,流程简单。缺点是读长短,不利于基因组de novo组装,并且对于单碱基重复序列准确率不高。

应用领域:小基因组测序(如微生物和病毒的从头测序和重测序,线粒体测序等)、扩增子重测序(16S宏基因组测序)、靶基因组测序、基因组/全外显子验证等。

3Ion Proton

Life Technologies公司于2012年宣布在中国推出新的台式基因测序仪Ion Proton system,旨在一天内完成人类基因组测序。Ion Proton™测序仪采用了新一代半导体测序技术,且芯片密度比Ion PGM™测序仪高1000倍,运行速度更快,单位时间的通量更高。

测序原理:离子半导体测序技术。

仪器特点:测序时长更短,两种通量芯片可供选择,单次可产生10-15Gb数据量,支持条形码读取并完成单片96个样本的测序。缺点是原始数据准确性相对不高,读长较多,平均最大读长为200bp

应用领域:适用于外显子(构成蛋白质的基因片段)测序,以及人类或植物基因组图谱绘制等大型测序工程。

4Ion S5/S5xl

201510月推出了Ion S5IonS5 xl,适用于靶向测序。该系统将多个gene panel和小的基因组集合起来,并简化操作流程和动手在操作时间,目前支持4种不同的芯片类型。

测序原理:离子半导体测序技术。

仪器特点:运行速度更快,需要样本少,不同通量的芯片可选。缺点是读长较短,数据分析工具和途径较少。

应用领域:可应用于癌症、遗传病、液体活检、感染性疾病领域。使用于靶向RNADNA测序,微生物、转录组、外显子组和RNA-seq

Thermo Fisher体系测序仪参数对比如表4所示:

4 Thermo Fisher体系测序仪器参数对比

ABI SOLID

Ion PGM

Ion Proton

Ion S5/S5xl

产出

160-320 Gb

30Mb–2Gb

Up to 10Gb

1.5-50Gb

读长

Fragment:35bp/50bp/75bp

PE:75bp *75bp/50bp *25bp /75bp *35bp

Mate-paired:60bp*60bp/2

*35bp/2*50bp

200bp/400bp

Up to 200-bp

200bp/400bp/600bp

Reads

0.7-2.8billion

4-5.5million

60–80 million

2–130M

运行时间

1-7d

2.3–7.3h

2–4 h

3-24h

备注:数据来源于Thermo Fisher官网和网络

四、华大智造测序仪——测序届的新贵

2013318日,华大基因对CG(Complete Genomics)公司全额收购,开启了华大测序仪之路。历经两年的研发和改进,华大基因推出了BGISEQ-500桌面化测序系统。之后又推出的BGISEQ-50MGISEQ-200MGISEQ-2000均取得了CFDA认证,还推出了MGISEQ-T7,华大测序体系得到了从8G6T通量的覆盖,应用领域也得到了极大的拓展。

1Revolocity

20156月推出了一款完全集成式的“超级测序仪”——Revolocity测序仪,该系统一年可完成10000-30000个全基因组测序,也支持全外显子测序。

测序原理cPAL技术。

仪器特点:适用于大规模WGSWES50ⅹ深度基因组测序仅需8天,50ⅹ深度下对人类基因组测序拷贝数变异和结构变异为96%,模块化处理全血和唾液用时少。缺点是目前仅限于人类全基因组测序。

应用领域全基因组测序和全外显子测序。

2BGISEQ-500

2015年华大基因推出了新型桌面化测序系统BGISEQ-500

测序原理:以cPAL技术和改进的DNA纳米球技术为核心技术。

仪器特点85%以上的数据高于Q30标准,多读长选择,双芯片平台,全自动文库制备系统和全自动样本加载系统,目前应用仅限于中国大陆地区。

应用领域NIPTPGSPM-Seq、染色体异常检测、WGSWESRNA-seq(定量)、转录组测序、ChIP-Seqsmall RNA等。

华大智造测序仪参数对比如表5所示:

5 华大智造测序仪器参数对比

BGISEQ-50

BGISEQ-500

MGISEQ-200

MGISEQ-2000

MGISEQ-T7

芯片类型

FCS

FCL

FCS

FCL&FCS

FC

Lane/芯片

1lane

2lane

1lane

4lane&2lane

——

运行模式

小通量

大通量

中通量

大通量

超高通量

读长

SE50

SE35-PE100

SE50-PE100

SE50-SE400

SE50-PE150

测序通量

8Gb

520Gb

60Gb

1440Gb

6Tb

有效reads

160M

1300M

280-300M

1500-1800M

5000M

运行时间

<15h

<9d

15-48h

4–55h

PE150<24h

备注:数据来源于华大智造官网

五、小结

罗氏454则在长读长、低通量和高精度需求领域还有少许应用。虽然罗氏454在二代测序仪名落孙山,但是并未放弃,其在临床检测领域也做出了许多的努力。

华大测序仪作为后起新秀,在不断布局,覆盖各种通量和测序领域,由于其成本相对较低,并且具有本土优势,市场较为看好。如果能够在敏感性与特异性之间做到平衡优化就更好了。

Thermo Fisher旗下的多种测序仪虽然市场占有相对较小,但是其主要服务的临床检测行业的市场前景还是非常向好的。如果能解决Ion Torrent平台的传感器在测量同一碱基连续出现时所产生的误差也势必会吸引更多的客户。

总体而言,目前市场的绝对占有还是Illumina公司,其测序平台之间具有高度互补性与交叉性,使得其在短读长测序上大占优势,但是在读取那些高AT或高GC富集的片段的时候错误率差强人意。并且随着精准临床诊断的兴起,Illumina也面临着巨大的挑战。

六、测序仪选择

以上,小翊给大家介绍了二代测序仪的基本情况,那怎么样才能选择一款合适的测序仪呢?其实二代测序仪选择主要基于仪器性能指标和临床需要。总体来说,临床实验室需要多种用途、性能稳定、性价比高和具有便于操作者试用的生物信息学工具的测序仪。可以综合考虑以下几个方面进行选择:

 

 










参考文献:李金明,高通量测序技术,2018,科学出版社。



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